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【摘要】 目的 探讨亚硫酸盐和雌激素及炎症因子在老年女性骨关节炎患者血清及关节液中的含量变化及其抗炎效应。方法 选择住院老年女性患者26例，年龄55～75岁，中位年龄67岁;病史1.8～25.6年，平均10年。均为我科初诊患者，根据骨性关节炎诊断标准确诊为膝骨关节炎，留取治疗前常规关节腔减压治疗时抽吸的关节液，及治疗后复查时的关节液。测定血清雌二醇水平、血清及关节液中的亚硫酸盐及白介素(IL-1、IL-6、IL-8)的含量变化。结果 老年女性膝骨关节炎患者的血清雌激素(雌二醇)水平显著低于对照组(P<0.01);急性期血清关节液中亚硫酸盐和炎性因子(IL-1、IL-6和IL-8)均较高，经治疗后恢复期时各值均显著下降(P<0.01)。再根据不同年龄段分组，测定不同年龄段的膝骨关节炎患者急性期血清及关节液中亚硫酸盐和炎症因子(IL-1、IL-6和IL-8)的变化，各炎症因子变化差异无统计学意义(P>0.05);而血清雌二醇水平随年龄增加而减低，差异有统计学意义(P<0.01);急性期骨关节液中亚硫酸盐水平随年龄增加而减低，差异有统计学意义(P<0.01)。随着年龄的增长，骨关节炎患者血清雌二醇水平与关节液中亚硫酸盐含量之间有相关性(R2=-0.991，P<0.05)。结论 亚硫酸盐和雌激素及炎症因子共同参与老年女性骨关节炎的发病过程，可能是一种生物活性分子在炎症局部发挥一定的病理生理学作用。 【关键词】 亚硫酸盐;雌激素;骨关节炎 【Abstract】 Objective To observe the changes of levels of sulfite，estrogen and inflammatory factors in serum and synovial fluids in elderly female patients with knee osteoarthritis (OA).Methods 26 elderly female hospitalization patients with OA diagnosed at first visit From August 2008 to August 2010 were enrolled in the investigation，and the patients’ age was between 55～75 years，median age was 67 years，with medical history between 1.8～25.6 years (mean 10 years).The patients’ synovial fluids were taken out during routine joint cavity decompression treatment before and after treatment，and the levels of serum estradiol，sulfite，interleukins including IL-1，IL-6，IL-8 in serum and synovial fluid were detected simultaneously.Results The levels of serum estrogen (estradiol) in elderly women with OA were significantly lower than those of control group (P<0.01)，and the levels of sulfite and inflammatory factors including IL-1，IL-6 and IL-8 in serum and synovial fluid at acute period were higher，however，after treatment the levels of these factors at recovery period were significantly decreased (P<0.01).There were no significant differences in the levels of inflammatory factors including IL-1，IL-6 and IL-8 among different age groups (P>0.05)，however，the levels of serum estradiol were decreased with the increase of age，and there were significant differences in the levels of serum estradiol among different age groups(P<0.05).The levels of sulfite in synovial fluid at acute period were decreased with the increase of age，and there were significant differences among different age groups (P<0.01).With the increase of age，the levels of serum estradiol in patients with OA were correlated with the content of sulfite in synovial fluid (R2=0.991，P<0.05).Conclusion The sulfite，estradiol and inflammatory factors are jointly involved in the pathogenesis of osteoarthritis in senile female patients，which may be a kind of bioactive molecule that plays certain pathophysiological role in inflammation local area. 【Key words】 sulfite;estrogen;osteoarthritis 骨关节炎(osteoarthritis，OA)是世界上第四大致残疾病，多累及髋关节和膝关节，随着年龄增加，其发病率亦显著增加，严重影响中老年人的健康和生活质量。老年、女性、超重和肥胖、膝盖受损、关节重复运动、骨密度、肌肉无力、关节松弛等都与OA的发病有关，尤其是负重关节的病变[1,2]。目前关于老年女性对OA的易感性增加的原因尚不完全清楚[3]。有关OA研究较多的炎症机制中白介素-1(IL-1)和TNF-α是研究的最早的细胞因子[4]。已知内源性亚硫酸盐在哺乳动物的炎性反应中发挥着重要的作用，它可能是中性粒细胞抗微生物因子和参与炎性反应的炎性介质[5]。因此，本课题拟通过收集中重度老年女性膝关节OA患者的关节液，测定其亚硫酸盐含量及炎症因子IL-1、IL-6和IL-8水平，并测定患者血清雌激素、亚硫酸盐和IL-1、IL-6和IL-8水平，初步探讨亚硫酸盐和雌激素、细胞因子三者在OA发病过程中的作用。 1 资料与方法 1.1 一般资料 2008年8月至2010年8月我院骨科住院老年女性患者26例为OA组，年龄55～75岁，中位年龄67岁;病史1.8～25.6年，平均10年。纳入标准[4]：(1)符合OA的诊断依据，分级标准为中重度;(2)至少6个月病史;(3)双侧膝关节OA，以症状严重侧入选;(4)无心血管、肝、肾等重要脏器病变;(5)排除活动性胃肠病变者及曾发生过消化性溃疡或胃十二指肠出血病史;(6)排除类风湿关节炎、感染性关节炎等其他关节疾患;(7)月经紊乱或自然停经24个月以上。所有病例均为我科初诊患者，就诊时近6个月未使用其他止痛药物、皮质类固醇药物及具有消炎镇痛作用的中药制剂。另选取26例妇科住院同年龄无OA患者作为对照组，研究血清雌二醇水平变化。 1.2 临床分组及标本留取 所有患者均在无菌操作下抽取患膝关节滑液，后注射玻璃酸钠注射液2 ml( 山东福瑞达医药集团),1次/周，连续5周。第8周末随访患者并在无菌操作下抽取患膝关节滑液。每次所取关节液2 ml以上，所得标本3 000 r/min，离心10 min取上清液200 μl，-70°C冻存。 所有患者均确诊OA，分级为中重度，需行关节腔减压治疗。共分为2组：(1)急性期：确诊膝DA，需行关节腔减压治疗;(2)恢复期：经5个疗程的关节腔内注射玻璃酸钠治疗，第8周复查患者。同时分析不同年龄段各因子的变化：(1)55～59岁：8例;(2)60～69岁： 7例;(3)70～75岁：11例。血清来自临床常规生化检测后剩余标本。 1.3 实验方法 1.3.1 亚硫酸盐含量测定：取关节液或血清100 μl，加入70 μl 硼氢化钠，室温孵育30 min，加入5 μl mBrB，充分混匀，42 ℃孵育10 min，然后加40 μl高氯酸混匀，12 400×g，室温离心10 min，取上清，加10 μl Tris液(2.0 mol/L，pH值3.0)轻轻混匀，12 400×g，室温离心10 min，留取上清液4 ℃避光保存。取标本5 μl进样分析，流动相A： 甲醇∶乙酸∶水(体积比5∶0.25∶94.75，pH值3.4) ，流动相B：甲醇。甲醇洗脱梯度：0～5 min 5%;5～10 min 35%;10～17 min 45%;17.01～22 min 100%;22.01～27 min 5%。流速：1.0 ml/min。激发波长392 nm，检测波长479 nm。标准曲线的测定：以Na2SO3作为标准品，稀释为如下浓度：0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4、6 μmol/L，按上述步骤处理后进行检测，绘制标准曲线(图1)。图1 亚硫酸盐标准曲线 1.3.2 IL-1、IL-6和IL-8：采用ELISA法检测，试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司，严格按说明操作，根据标准曲线求出样品中IL-1、IL-6和IL-8的含量。 1.4 统计学分析 应用SPSS 10.0软件统计，计量资料以x-±s表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 2组血清雌二醇水平比较 OA组的血清雌激素(雌二醇)水平(258±85)pmol/L显著低于对照组(349±92)pmol/L，差异有统计学意义(t=4.854，P<0.01)。 2.2 OA患者血清亚硫酸盐与炎性因子水平变化 OA患者急性期血清亚硫酸盐和炎性因子(IL-1、IL-6和IL-8)较高，恢复期时各值均显著下降(P<0.01)。见表1。表1 OA组血清亚硫酸盐与炎性因子水平变化 2.3 OA组患者关节液亚硫酸盐与炎性因子水平变化 OA患者急性期关节液中亚硫酸盐和炎性因子(IL-1、IL-6和IL-8)水平较高，经治疗后恢复期各值均明显下降(P<0.01)。见表2。表3 OA组关节液中亚硫酸盐与炎性因子水平变化 2.4 不同年龄阶段患者急性期血清亚硫酸盐与炎性因子水平变化 不同年龄段的膝骨关节炎患者急性期血清中亚硫酸盐和炎性因子(IL-1、IL-6和IL-8)差异无统计学意义(P>0.05);而血清雌二醇水平随年龄增加而减低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。 2.5 不同年龄阶段患者急性期膝关节液中亚硫酸盐与炎性因子水平变化 不同年龄阶段的膝OA患者急性期膝关节液中炎症因子(IL-1、IL-6和IL-8)变化差异无统计学意义(P>0.05);但是，亚硫酸盐水平随年龄增加而减低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表4。表3 不同年龄段急性期血清亚硫酸盐和炎症因子水平变化表4 不同年龄段关节液中亚硫酸盐和炎性因子水平变化 2.6 膝OA患者血清雌二醇水平与关节液中亚硫酸盐水平相关性分析 OA患者血清雌二醇水平与关节液中亚硫酸盐含量之间有相关性(R2=-0.991，P<0.05)。 3 讨论 OA是一种慢性退化性关节疾病，以中老年人发病为主，并以进行性关节软骨破坏及关节边缘赘骨形成为特征，引起局部疼痛的骨关节病，绝经期后女性患者明显多于男性[3]。OA发病机制目前尚不明确，主要病理改变是关节软骨的退行性变和继发性骨质增生，在力学和生物学因素共同作用下导致软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨质三者降解合成失衡[6]。Sowers等[7]通过测定绝经期及围绝经期女性性激素水平发现血清雌激素水平降低可增加OA患病的风险性。国内亦有学者报道绝经期膝关节OA患者雌激素水平明显降低，而相关炎症因子明显增高，表明雌激素在OA的发病过程中发挥重要作用。 由于OA是一个复杂的多因子的关节退行性病变，其发病过程有多种机制参与[8-11]。除外肥胖和免疫系统的老化，炎症是一主要发病机制，通过改变细胞因子体系参与骨性关节炎的发病，IL-1和TNF-α是研究的最早的细胞因子。促炎症因子IL-1和TNF-α能够控制关节软骨基质的退行性改变，目前已采取了针对IL-1和TNF-α的治疗措施。除了IL-1和TNF-α，已证明IL-6、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、白血病抑制因子和趋化因子IL-8在OA的发病中也发挥重要的作用，也可能作为靶向治疗的靶点[12,13]。IL-1主要由单核细胞合成，它还是成纤维细胞、软骨细胞、巨噬细胞、滑膜细胞和内皮细胞的产物。已有研究报道膝关节滑膜细胞经培养后，其上清液中IL-1主要以IL-1β为主[14]，它是构成细胞外IL-1的主要成分。炎症情况下，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子水平升高，促进IL-1的上调，增加IL-1β的合成;另外关节滑膜细胞也可自分泌IL-1β。 近年来，有关气体信号分子在关节炎的发病过程中的作用已有报道，Cillero-Pastor等[15]研究发现一氧化氮(nitric oxide，NO)可以通过调节线粒体功能降低OA患者滑膜细胞的活性。Whiteman等[16]通过检测类风湿性关节炎、骨性关节炎和健康志愿者的关节滑液中的硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)进行研究，发现三者血浆H2S无明显差异，而类风湿性关节炎关节滑液中的H2S含量显著高于骨性关节炎和健康志愿者。由此可以看出，气体信号分子在关节炎的发病过程中发挥一定的病理生理学作用。 已知内源性二氧化硫在体内以亚硫酸盐形式存在，是中性粒细胞抗微生物因子和参与炎性反应的炎性介质[5]。本课题研究发现老年女性骨关节炎患者的血清雌激素(雌二醇)水平显著低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01);急性期血清膝关节液中亚硫酸盐和炎症因子(IL-1、IL-6和IL-8)均较高，经治疗后恢复期时各值均显著下降(P<0.01)。而根据不同年龄分组测定发现不同年龄阶段的膝关节炎患者急性期血清中亚硫酸盐和炎性因子(IL-1、IL-6和IL-8)差异无统计学意义(P>0.05)而血清雌二醇水平随年龄增加而降低，差异有统计学意义(P<0.01);急性期骨关节液中炎性因子(IL-1、IL-6和IL-8)变化各年龄阶段差异无统计学意义(P>0.05);而亚硫酸盐水平随年龄增加而减低，差异有统计学意义(P<0.01)。有意义的是骨关节炎患者血清雌二醇水平与关节液中亚硫酸盐含量有相关性(R2=-0.991，P<0.05)。 内源性SO2含量极低，既往研究发现正常大鼠血清内源性SO2含量为(15.54±1.6) μmol/L，肺组织中为(3.92±0.46)μmol/L[17]。Mitsuhashi等[5]通过动物实验发现，给Wistar大鼠注射LPS后血清亚硫酸盐含量显著升高，而应用免疫抑制剂阻断亚硫酸盐的释放后可增加大鼠对细菌的敏感性，加剧炎性反应。在细胞水平发现脂多糖(LPS)可刺激中性粒细胞，使之释放大量的亚硫酸盐，提示亚硫酸盐与炎性反应密切相关。Mitsuhashi等[18]还发现肺炎患者血清亚硫酸盐水平显著升高，恢复期血清亚硫酸盐水平较急性期降低。Yang等[19]研究表明亚硫酸盐可通过刺激A549细胞释放IL-8参与机体的炎性反应。本研究中骨性关节炎患者血清及关节液中SO2含量升高可能主要是由于炎性反应时，引起含硫氨基酸的代谢异常，这种代谢改变可调节内源性SO2的生物合成，导致SO2水平升高。 雌激素可抑制软骨细胞增生，增强软骨细胞RNA的表达，促进其蛋白多糖和胶原的合成，以及碱性磷酸酶和肌酸激酶的特异性表达。雌激素通过传统的核受体和膜介导途径作用于软骨细胞。雌激素的特异性受体在关节软骨、生长板和骨痂中均有发现。Stevens-Lapsley等[3]提出OA在女性患者多发主要与性激素水平、肥胖和运动量等有关。Afzal等[20]研究了绝经期妇女OA患者血清雌激素和IL-6水平，发现OA患者血清IL-6显著升高，而血清雌激素水平明显降低，且二者存在一定相关性(P<0.05)。本试验研究发现OA女性血清雌二醇水平降低，这与文献报道一致。我们通过相关性分析发现血清雌激素水平随年龄降低的同时关节液亚硫酸盐水平亦随之升高，二者具有显著相关性。 总之，内源性亚硫酸盐与雌激素及炎性因子在骨性关节炎的发病过程中发挥着重要的生物学效应，具有一定的抗损伤作用及抗炎症效应，亚硫酸盐可能是一种生物活性分子在炎症局部发挥一定的病理生理学作用。
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